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È sulla base di dati epidemiologici storici e recenti, forniti dall’ISTAT, dalla LILT di Lecce, dall’Osservatorio Epidemiologico Regionale Pugliese, dal Registro Tumori della Provincia di Lecce, nonché dal recentissimo studio specifico condotto dall’Istituto Superiore di Sanità, che si è proceduto a individuare Aree provinciali a più elevato, intermedio e più basso rischio oncologico.
Proprio lo studio dell’Istituto Superiore di Sanità ha individuato un cluster di mortalità ed incidenza significativa di tumore polmonare maschile nell’area centrale salentina, che riguarda 16 Comuni, così come riportato nella stesura del progetto (Giada Minelli, 2014. "Il tumore polmonare nella
provincia di Lecce: analisi di
Cluster di incidenza e mortalità").
Tale dato è peraltro pienamente in linea con quello storico di mortalità.
La selezione dei Comuni e dei siti dove eseguire i campionamenti è stata tuttavia dettata non solo dal dato epidemiologico (aree ad elevato, intermedio e basso rischio), ma anche da ragioni di opportunità geografica, al fine di garantire una campionatura distribuita sull’intero territorio provinciale.
Abbiamo così disegnato:
Per tutti i 32 Comuni coinvolti dallo studio si sono analizzati i campioni di terreno, ricercando: Metalli pesanti, IPA, Pesticidi; ed eseguiti i test di genotossicità.
Per le 9 Aree oggetto di studio, invece, si è proceduto ad eseguire il test per diossine, furani e PCB, utilizzando un campione di suolo per Area, derivante dalla miscela dei prelievi provenienti dai Comuni selezionati per quella data Area.
In tutti i 32 Comuni coinvolti dallo studio si sono analizzati i campioni di terreno.
I campioni sono stati prelevati da parchi, giardini di ville storiche, antichi casali e zone verdi in genere, all’interno delle quali il terreno non era stato rimaneggiato nell’ultimo decennio e soprattutto, non era soggetto ad attività agricole di fertilizzazione e/o altre pratiche che potessero inficiare le analisi.
Ulteriore ragione della scelta di tali aree è stata la constatazione che, essendo incolti, i terreni scelti non avevano subito di recente il rimescolamento degli orizzonti pedologici e quindi si poteva ritenere che gli inquinanti eventualmente presenti del top soil fossero dovuti in gran parte alle deposizioni secche e umide. L’unica azione chimica ipotizzabile a cui tali inquinanti sono stati sottoposti è stata quella della mobilità chimica, biologica e ai dilavamenti ad opera delle acqua meteoriche.
I campionamenti di terreno sono stati effettuati tra febbraio e settembre del 2017.
Per ogni comune, con la collaborazione degli uffici tecnici del luogo, sono stati individuati quattro siti di campionamento. In ogni sito scelto, su una superficie di almeno 50 metri di diametro, sono stati individuati più punti di campionamento di superficie 30 x 15 cm da cui sono stati prelevati diversi campioni di top soil, previa asportazione dello strato erboso, e ad una profondità di circa 10-15 cm. Tutti questi campioni, accuratamente mescolati sono stati messi in contenitori sui quali è stata apposta una etichetta contenete numero dell’area, il comune, la data di campionamento e le coordinate geografiche del sito.
I campioni di suolo, quattro per ogni comune, sono stati essiccati all’aria, sbriciolati e setacciati con vaglio a 2 mm (terra fine), ottenendosi così quattro sub campioni per comune. Tali sub campioni sono stati mescolati in parti uguali ottenendosi così il campione definitivo da sottoporre ad analisi. Per la caratterizzazione fisico meccanica dei campioni sottoposti ad analisi è stata determinata su ciascuno di essi la composizione in Sabbia grossa e fine, argilla e limo. Inoltre su ciascun campione è stato determinato il pH e il potenziale di ossido-riduzione.
Un’aliquota di terra fine, ottenuta come detto in precedenza, è stata finemente polverizzata in mortaio d’agata e 500 mg di essa sono stati mineralizzati in forno a microonde in contenitori di teflon con acqua regia (HCl:HNO3 3:1) come richiesto dalla normativa in vigore.
La determinazione dei metalli è stata effettuata mediante Assorbimento atomico con fornetto di grafite e correttore al deuterio. L’Arsenico è stato determinato in AA con la tecnica degli idruri. Il Hg è stato determinato con la tecnica dei vapori freddi secondo EPA 7471A. Il Cr (VI) è stato determinato con il metodo EPA 3060A (US EPA, 1996) che prevede una estrazione in ambiente alcalino e la successiva determinazione spettrofotometrica secondo EPA Method 7196 (USEPA, 1995).
L’AA permette di determinare i metalli con una elevata sensibilità analitica e rappresenta per molti metodi ufficiali la tecnica di riferimento. Le curve di taratura per ciascun metallo sono state costruite intorno al valore medio atteso per quel metallo, permettendo così un abbassamento del limite di rivelabilità. Per la costruzione di tali curve sono state usate soluzioni standards certificate. Gli acidi usati erano certificati per il loro contenuto in metalli.
Sono stati allestiti dei test di tossicità acuta e cronica utilizzando l’organismo bioindicatore Eisenia foetida,riferimento alle norme ISO (ISO 11268-1 ; ISO 11268-2, OECD 2004).
Eisenia foetida è una specie di anellide o ligochete ampiamente utilizzata sia in agricoltura per la produzione di humus, sia in ambito ecotossicologico per test di tossicità sul suolo.
La tossicità acuta dei campioni di terreno in esame è stata quantificata attraverso l’applicazione di un test che consiste nel misurare la mortalità degli animali dopo 14 giorni di esposizione al terreno da analizzare.
Il test di tossicità cronica valuta invece gli effetti tossici provocati da tempi di esposizioni prolungati. In tal caso il test ha una durata maggiore, corrispondente a 8 settimane in modo da poter osservare la crescita degli organismi, lo sviluppo e la produzione della prima generazione. Infatti, in questo test si valutano gli effetti negativi sulla
riproduzione della specie test.
Quindi per effettuare tali test sono stati acquistati circa 50.000 lombrichi della specie suindicata e sono state allestite delle vasche di mantenimento all’interno dell’orto botanico dell’Università del Salento.
Quindi dopo un periodo di acclimatamento sono stati prelevati circa 750 lombrichi i quali sono stati utilizzati per la messa a punto dei test di tossicità acuta e cronica. Sono stati utilizzati per la prova unicamente lombrichi adulti, sessualmente maturi, con età compresa tra 2 mesi e 1 anno e dotati di clitello ben sviluppato.
I lombrichi sono stati acclimatati per 1-7 giorni in terreno artificiale (preparato secondo le Linee Guida 207 dell’OECD). Durante questo periodo i lombrichi sono stati nutriti con lo stesso cibo che è stato poi utilizzato durante il saggio.
I dati ottenuti sono serviti per poter effettuare dei confronti tra il tempo di partenza dei test di
esposizione (t=0) e il tempo di rimozione degli animali dai box contenenti i terreni da controllare (t=30), la conta della mortalità è stata effettuata dopo 14 giorni di esposizione (t=14).
I lombrichi sono stati esposti a campioni di terreno proveniente dai Comuni delle aree dal progetto Geneo, prelevati entro i primi 50 cm di profondità. Prima dell’inizio dei test, i terreni oggetto di valutazione sono stati reidratati con una quantità di acqua distillata pari al 15-20% del peso totale delle quantità da analizzare (1 Kg per box). Tale reintegrazione ha fornito ai terreni l’umidità necessaria affinché gli animali utilizzati non avessero stress di tipo idrico.
In accordo con le indicazioni del metodo standard, i contenitori all’interno dei quali è stato eseguito il test avevano una capacità di 1 litro e un’area di sezione trasversale all’incirca di 200 cm in modo da raggiungere l’altezza di circa 5-6 cm di substrato umido quando si aggiunge unaquantità equivalente a 500-600 g di sostanza secca.
È stata realizzata sui contenitori una copertura trasparente e forata in modo da permettere lo scambio gassoso tra il substrato e l’atmosfera, permettere l’accesso della luce e, soprattutto, per prevenire la fuga dei lombrichi.
All’interno di ogni contenitore sono stati posti 10 lombrichi e, tali contenitori, sono stati alloggiati all’interno di una camera climatizzata. Ogni determinazione è stata effettuata in tre repliche.
I lombrichi sono stati accuratamente lavati e asciugati e, successivamente posizionati su carta assorbente per un breve periodo, per permettere l’eliminazione dell’acqua in eccesso. Gli animali utilizzati avevano un peso iniziale unitario omogeneo e sono stati sottoposti alle seguenti condizioni di prova: aerazione continua, umidità controllata, temperatura di 20 + 2 °C. Il saggio è stato effettuato con cicli controllati di luce/buio (16 ore di luce e 8 di buio) con illuminazione variabile tra 400 e 800 lux nell’area dei contenitori. I lombrichi sono stati pesati individualmente prima di essere collocati nei contenitori per l’inizio del saggio.
Una volta pesati, gli animali sono stati depositati sulla porzione superficiale del suolo in ciascun contenitore al fine di valutare qualitativamente lo stato di salute degli animali. I lombrichi in buono stato di salute, normalmente, si interrano subito sotto la superficie del substrato e, di conseguenza, quelli che rimangono in superficie dopo 15 minuti possono essere danneggiati e devono essere sostituiti. Tutti i lombrichi selezionati hanno dimostrato uno stato di salute buono superando positivamente la prova.
Il contenuto idrico del substrato di suolo nei contenitori è mantenuto costante durante il periodo dei tests tramite pesate periodiche dei contenitori. L’acqua persa è rinnovata come necessario in modo tale che alla fine dei test, il contenuto d’acqua non differirà per più del 10% da quello di partenza.
Durante l’esecuzione dei test gli animali sono alimentati con concime bovino secco reidratato. In particolare, il giorno dopo aver aggiunto i lombrichi ai contenitori per i tests sono stati forniti circa 5 g di cibo secco finemente tritato, sparsi sulla superficie del suolo di ogni contenitore e inumiditi con acqua distillata (da 5 a 6 ml per contenitore). Successivamente, il cibo è fornito una volta alla settimana.
Dopo 14 giorni di esposizione è stata effettuata la conta e la misurazione dei pesi medi dei lombrichi sopravvissuti quindi sono inoltre registrati cambiamenti nel comportamento (incapacità di interrarsi, immobilità dopo stimolo esterno) e nella morfologia. Dopo 28 giorni i lombrichi sono stati rimossi dai contenitori. Il suolo privato dei lombrichi adulti ma contenente i bozzoli prodotti (cocoon) è stato posto in incubazione per ulteriori 28 giorni con le stesse condizioni del saggio eccetto per il fatto che il nutrimento è stato somministrato solo una volta all’inizio di questa fase.
Al termin e delle prove si è determinato il numero di giovani prodotti. Sono stati anche registrati eventuali segni di danno presentati dai nuovi nati. Sugli organismi rimossi al 28 giorno di esposizione sono stati effettuati le misurazione dei biomarkers richiesti.
